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最后更新：2017-06-26
关 注 度：2985
生产企业：深圳市国泰宜丰科技有限公司
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产品详细介绍 PSI Clone BAC DNA 分离试剂盒
PSI Clone BAC DNA试剂盒能够便利地分离出高质量的BAC DNA。所获的DNA足够用于至少一次测序反应以及其它生化定性分析（例如限制性酶切）。一般从过夜培养的3-5mL培养物中可以获得0.6-1.0μg DNA。
细菌人工染色体作为载体，含有从F因子附加体中获得的复制起点。这使得大的DNA片断（>150kb）的稳定克隆成为可能。F因子的复制起点是一种严紧型的复制子，它只允许单个细胞中的每个BAC分子产生1-2个拷贝。BAC克隆的低拷贝数使其潜在的产量限制在100-200ng/ml。现在的流程需要大体积的培养物（50-200mL）以获得足够纯的mg级的BAC DNA用于分子操作。这些分离BAC DNA的大体积的流程一般包括酶解步骤或有机抽提，而且许多是各个实验室所独有的的方法。PSI Clone BAC DNA试剂盒利用了简单的离心柱的流程，不需有机抽提就能获得高纯度的BAC DNA。
试剂盒组分
重悬缓冲液（1） 13 ml RNA 酶A 1 Vial
裂解液（2） 13 ml BAC DNA柱 25 ea
中和缓冲液（3 ） 13 ml Tube管架 4 ea
平衡缓冲液（4） 15 ml PSI 压力枪头 1 ea
清洗缓冲液（5） 50 ml 说明卡 1 ea
洗脱缓冲液（6） 10 ml 包括在了BAC柱包装中
PSI Clone BAC DNA试剂盒使用方法（适用于3-5mL培养物）产品号 PP-120。
推荐使用含有20 μg/mL氯霉素的 Terrific Broth培养基时，生长培养20-24小时，OD600可达4-6。
1. 加0.5mL重悬缓冲液于RNase A管，温和混匀，
2. 将过夜培养的3-5mL培养物离心，倒掉培养基。
3. 轻轻地吹打细胞沉淀使其重新悬浮于0.5mL含有RNAse A重悬缓冲液中，再转到一个干净的1.5mL的EP管中。
4. 加入0.5mL裂解缓冲液（2），轻轻地上下倒转混合（注：裂解物可以不清亮），室温放置10分钟。
5. 加入0.5mL中和缓冲液（3），轻轻地上下倒转混合直到浓浓的白色沉淀物形成，冰浴10分钟。
6. (20,000 x g)离心10分钟，将上清液收集并转到一个无菌试管中（如15 mL Falcon试管或类似的试管）。
7. 用1.0mL无菌水稀释已澄清裂解物，吹打均匀。
8. 将0.5mL的平衡缓冲液（4）加入到BAC离心柱上，震荡，控干离心柱。
9. 将稀释好的裂解物加到离心柱上，控干离心柱。可以用PSI Pressure枪头启动裂解物的流动。
10. 用1.0mL清洗缓冲液（5）清洗BAC离心柱2次，控干，750 x g离心2分钟，干燥离心柱。
11. 将50-100μL的洗提缓冲液加入到树脂的顶端，室温孵育2分钟，750x g离心2分钟，收集洗提液。
12. 加1倍体积的异丙醇并混匀，以沉淀BAC DNA。20,000 x g离心30分钟，沉淀DNA。弃去上清，用200μL 70%乙醇清洗沉淀。20,000 x g离心5分钟，弃去乙醇，风干。
13. 将沉淀重悬于20μLTE或其它低盐缓冲液中。
未提供但必须的材料：
微型离心机
无菌试管和1.5mL小离心管
冰浴
2-丙醇
70％乙醇
推荐的测序条件：
利用ABI PRISM BigDye Terminator 循环测序预备反应可以完成测序过程。
试剂盒如下
Template 200-400 ng in 11.0 μL
Primer M131 3.2 pmol in 1.0 μL
Reaction Mix 8.0 μL
Total 20
PCR conditions (Perkin Elmer 9600):
Step 1. 98C for 5 min
Step 2. 98C for 30 sec
Step 3. 55C2for 20 sec
Step 4. 60C for 4 min
Step 5. Cycle to Step 2 30x
Step 6. 60C for 5 min
Step 7. 4C for Variable Time
1M13 前面的引物序列 GTA AAA CGA CGG CCA GT (Tm = 53) 出现在pBeloBAC11中。
2退火温度可以根据引物不同而有所改变。
测序产品是用CENTRI SEP（Princeton Separations, Catalog # CS-901）纯化的，并且在Savant Speed-Vac中干燥。
把所有的测序反应物都加到胶上以获得充足的信号是很重要的。将反应物重悬在最小体积中（如1μL），并且要把孔中所有的反应物都加上样。
一些有帮助的信息：
裂解不完全或者培养密度太高会导致染色体DNA过多。稀释培养物使得OD600为6.0，每次取样时取5mL稀释的培养物。
裂解的过程中不要震荡样品，轻轻地颠倒样品几下就足够了。
不要缩短孵育时间否则染色体DNA将不会沉淀。
如果离心时的离心力达不到20,000 x g，则需要延长离心时间使得离心力与时间的乘积大致相等。
第7步中用无菌的试剂级的水稀释澄清的裂解产物，这样不会堵住柱子基质。稀释的裂解产物流出很慢可能是因为基质或玻璃材料中有气泡阻塞。PSI Pressure Tip（压力枪头）可以帮助裂解产物流出来。把Pressure Tip装在一个3mL的注射器上，把枪头直接插入柱子中挤压活塞使裂解产物以每秒1滴的速度往下流。
第10步务必根据说明离心出剩余的清洗缓冲液。11步中在回收洗脱液之前使洗脱缓冲液在基质中孵育至少2min。
DNA的丢失经常出现在沉淀这一步。沉淀几乎看不到主要是因为DNA的含量很少（大约1mg）。离心的时候离心管的方向最好是一致的，这样就会知道沉淀在什么地方。吸出上清的时候要注意不要把沉淀带走。
如果以前产量很高的克隆出现产量很少的问题（每个样品<50ng），通常是由于重组导致了插入片段的丢失。此时可用限制性酶切和电泳来确定一下插入片段的大小。由于BAC的插入片段有固定的拷贝数，所以重组会导致插入片段变小及产量的减少。
从某些E.coli菌株（如HB101及其衍生系）中分离出的DNA不太适合测序用。我们建议使用DH10B宿主菌株。
PSI Clone BAC DNA 试剂盒产品号 PP-120
使用重力/离心柱流程，伴随碱性裂解法，该试剂盒可以从3-5mL培养物(OD600Η4-6)中分离0.6-1μg BAC DNA，且仅用200 ng做模板即可得到极好的测序结果。由此表明该试剂盒的高纯度性。每包装使用25次。
订货信息：
货号 规格
PP-120 BAC DNA Kit - 25 preps
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| 会员级别：免费会员 |
| 加入时间：2017-01-11
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